水产养殖弧菌试剂盒，水产弧菌快速检测盒使用方法

水产养殖弧菌试剂盒，水产弧菌快速检测盒使用方法

水产养殖弧菌试剂盒的作用

吲哚试验是指有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚(靛基质)，经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，则为吲哚试验阳性。

水产养殖水质试剂盒

水质监测仪器或试剂盒，剪刀，显微镜，网，笔记本，尺子，称等等！

弧菌检测试剂盒

全自动微生物鉴定仪特点是光电一体化技术，智能化功能，和细菌自动生化培养、结果判定和打印报告；相配套的高敏感性生化试剂盒，给临床常见病菌的鉴定打下了快速、准确和稳定的基础。

主要技术指标：

（1）应能鉴定全国临床检验操作规程中规定的肠杆菌、非发酵菌、弧菌、葡萄球菌、链球菌和真菌。

（2）鉴定的准确性：选用常见菌检出率应不低于95%（包括生化试剂盒）。

（3）重复性：对某一种常见菌重复检出的不一致性应不大于3。

（4）药敏鉴定：对可行的常见菌的药物敏感性结果进行处理。

水产弧菌培养基的使用方法

选择培养基是在培养基中加入某种化学物质,使之抑制某些细菌生长,而利于另一些细菌的生长,从而使后者从含有杂菌的标本中分离出. 如副溶血弧菌常用的高盐培养基,可以抑制某些细菌的生长从而将其筛选出来,是选择培养基,

水产杀弧菌药配方

蛭弧菌不属于渔药范围内，农业部于2015年10月1日起禁止使用噬菌蛭弧菌微生态制剂。蛭弧菌是寄生于其他细菌（也可无寄主而生存）并能导致其裂解的一类细菌。

水产弧菌测试盒图解

蛭弧菌在水产养殖中的作用包括：①改善水质，促进水 产动物生长。

蛭弧菌可分解养殖水体中的残饵，代谢废物，降解水 中氨氮等有害物质，改善水质环境，用药后6小时就能见效。

乾界生物早在1979年就开始了蛭弧菌的研发，是日本最早研发蛭弧菌的公司，蛭弧菌具有高活性高复制力，能够精确识别治病弧菌强力攻击裂解弧菌，针对弧菌（黄弧菌、绿弧菌）有显著作用

水产养殖弧菌试剂盒的作用是

我们应用PCR技术，放大EHP的18SrRNA基因，再用标记地可辛的探针探测原位杂交细胞中被感染的EHP，最后开发新的PCR技术探测对虾组织，排泄物和水中的EHP。

2.材料和方法

2.1对虾

2006年在文莱收集了感染对虾肠孢子虫（EHP）的南美兰对虾。2014年和2015年在越南虾塘里收集了感染EHP的南美白对虾。2014年，从泰国运送了一批南美兰对虾到我们亚利桑那大学的实验室进行隔离检测，这些对虾后来被检测出感染了EHP，它们的肝胰腺，排泄物和水进行了PCR技术取样检测。

为了检测原位杂交（ISH），并通过PCR技术分析EHP的特异性，研究人员使用了具有棉虾病临床症状的斑节对虾样本，这些对虾来自2005年（固定组织）和2006年（冰冻组织）的马达加斯加。还使用了感染了鳄组织变形虫的南美白对虾，这些虾是在2014年收集到的。通过PCR技术分析，肝胰腺组织或者整只对虾被保护在95%的酒精当中或被风干后送往我们实验室。通过原位杂交技术，用戴维森固定法将虾固定。

2.2.DNA提取

从感染EHP的对虾中去除肝胰腺，（4-5只虾）放进一个样本中。装运感染EHP的对虾的虾槽中对排泄物和水进行了取样。利用MicrosepAdvance离心装置（PALL公司）将虾槽里的水浓缩150倍，用于DNA提取。用一种高纯度DNA模板制备工具（RocheBioscience）或Maxwell-16Cell LEV DNA纯化试剂盒（Promega）。

为了测试EHP引物的特异性，PCR扩增检测两种寄生虫病中的DNA：

（1）棉虾病，2006年从马达加斯加收集了斑节对虾，这些虾的肌肉变白，通过rRNA基因测序，发现它们的DNA呈阴性，因为内有类似于匹里虫的微孢子虫（GenBankkp825331号）；

（2）变形虫病，这些南美白对虾大量死亡，通过组织学检查，最后发现这些虾感染了变形虫（种类不确定）。

为了保证EHP引物没有宿主基因组的反应，制备DNA模板：

（1）来自美国夏威夷的无特定病原（SPF）的南美白对虾（>10样本）、斑节对虾（3个样本）；

（2）来自沙特阿拉伯的印度对虾（2个样本）；

（3）在新喀里多尼亚养殖的南美兰对虾（2个样本）；

（4）来自菲律宾的罗氏沼虾（2个样本）；

（5）沙特阿拉伯附近虾塘里采集的蟹（7个样本，未知的物种）；

（6）多毛类（3个样本），卤虫生物量（9个样本），鱿鱼（2个样本），磷虾（2个样本），这些是从各种商业供应商运送。

2.3.18S rRNA基因扩增和克隆

PCR检测技术，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE医疗）。扩增18SrRNA基因的引物18S-F（5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA）和18S-R（5’-TCTGAAATAGTACGGGCGG）。PCR反应中包含200微米dNTP，0.2微米引物，10mM Tris-HCl（pH9.0）,50毫米氯化钾，1.5毫米氯化镁，2.5U Taq DNA聚合酶和1微升提取的DNA（10纳克至100纳克每微升）。放大进行下列循环参数：到达94°C进行初始化3分钟，然后94°C温度下进行30秒，55°C温度下进行30秒，72°C温度下进行1分钟，做35个此循环周期，并在最后一个周期停留在72°C温度下5分钟。在一个含有溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物。在?1KB一带切除和提取DNA，克隆到pGEM-T-easy载体（Promega）上，命名为克隆pEHP-1。通过DNA测序，克隆的插入为1146bp（GenBankNo.kp759285）。国家生物技术信息中心（NCBI）使用BLAST序列数据库对GenBank的相似序列进行了搜索。

2.4、探针标记和原位杂交

克隆pEHP-1质粒DNA被用来做成原位杂交时的一个探针。Mari等人描述，在PCR反应中，使用了digoxigenin-11-dutp（Roche）标记的基因探针（1998）。用于标记反应的引物EHP-F（5’-GGGAACGACGAACGGCTCAG）和EHP-R1（5’-TGCCTTGATGAGACACTGTT）产生一个1.1 kb的片段。digoxigenin标记的DNA探针，用乙醇沉淀，悬浮在水中，并存储在-20°C。棉虾病，感染了类似于匹里虫的微孢子虫的探针如微孢子虫，是从一个克隆的16SRNA基因区域产生。

戴维森的AFA固定虾进行了处理，石蜡包埋，按照标准方法切片（4微米厚）（莱特纳，1996）。经过脱蜡，水化，蛋白酶K消化，和后固定，切片浸泡在用500微升的杂交液中（4×SSC，50%甲酰胺，1×登哈特的溶液，5%硫酸葡聚糖，0.5微克/毫升鲑鱼精DNA），这种杂交液中含有EHP探针含（0.2μg/ml）。切片放在90°C加热表面上10min，然后在42°C温度下进行一夜的杂交。最终采用硝基蓝四氮唑，5-溴-4-磷酸进行检测抗地高辛抗体共轭碱性磷酸酶（罗氏）。

2.5.EHP的PCR检测。

PCR检测技术，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE医疗）。探测EHP的引物是EHP-510F(5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT)和EHP-510R(5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA)。放大进行下列循环参数：到达94°C进行初始化3分钟，然后94°C温度下进行30秒，60°C温度下进行30秒，72°C温度下进行30秒，做35个此循环周期，并在最后一个周期停留在72°C温度下5分钟。

3.结论与讨论

3.1临床症状与EHP感染史

目前，养殖对虾过程中所发生的EHP感染还没有特定的的临床症状。EHP感染通常与发育不良和死亡率上升有关。根据越南境内的鱼塘数据（虾农个人提供的数据）：把感染后的虾苗放入虾塘后的前25天时间内，对虾生长速度正常，之后，对虾的健康状况开始恶化；受感染的对虾饲料进食量减少（50-70%），肝胰脏变色。对虾受到感染之后，其体型（即重量，每周进行一次称重）仅为健康对虾的10-40%。对虾EHP感染死亡率并非一成不变，根据养殖场统计，对虾每天的死亡率约为1?2%。在实验室测定过程中，对虾EHP死亡率并无显著上升，（Tangprasittipap，2013），由于测定持续周期较短（7天），有可能无法检测出死亡率的大幅变化。情况较为严重的EHP感染可能会增加其他细菌感染的易感性。我们发现，在某些情况下，EHP通常伴有弧菌机会性感染（也称为感染性肝胰腺坏死），这可能会导致增加对虾死亡率。

混合养殖

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